МЕДИЦИНСКИЕ АНАЛИЗЫ 

Опыт более 20 лет ! 

(831)412-96-22

Скидки
Получение результатов анализов
Если у Вас возникли трудности с авторизацией, свяжитесь с нами!
Заявка на возврат НДФЛ
Генетические исследования - предрасположенность к заболеваниям:
Диагностика инфекционных заболеваний:
Диагностика паразитарных заболеваний:
Биохимические исследования:
Диагностика гормонов и онкомаркеров:
Читайте нас на страницах:
вконтакте
Система Orphus

Прайс листInternet-магазинвопрос врачупочетный клиент
Полезная информация

ПЦР

Что такое ПЦР?

Конец ХХ века ознаменовался целым рядом фундаментальных открытий в области молекулярной биологии. Это дало мощный толчок для разработки и внедрения, прежде всего, в биологию, генетику и медицину, принципиально новых методов выявления и идентификации ничтожно малых количеств генетического материала. Одним из самых ярких событий стало открытие и разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). В 1983 г. американский биохимик Кэри Б. Мюллис (в последующем лауреат Нобелевской премии) открыл удивительно простой метод получения фрагментов ДНК в неограниченном количестве. Вот как весьма образно описывает это сам Мюллис (из публикации в журнале Scientific American, June, 1990): …"Иногда удачная идея приходит в голову совершенно неожиданно. Со мной, например, это случилось в одну из апрельских ночей в 1983 г., когда я, сидя за рулем автомобиля, пробирался по освещенной лунной дороге в секвойные леса Северной Калифорнии. Мысль моя случайно натолкнулась на процесс, благодаря которому можно получать копии генов в неограниченных количествах. Теперь его называют полимеразной цепной реакцией. ПЦР дает возможность в течение дня из одной молекулы ДНК получать 100 млрд. сходных по структуре молекул. Эта реакция очень проста в исполнении: нужны лишь пробирка, несколько простых реагентов и источник тепла. Препарат ДНК, который необходимо копировать, может быть чистым, а может представлять собой очень сложную смесь биологических веществ. В качестве источника ДНК подходит и биоптат ткани пациента, и одиночный человеческий волос, и капля засохшей крови, обнаруженная на месте преступления, и мозг мумии и даже тело мамонта, пролежавшего 40 тысяч лет в вечной мерзлоте. За семь лет, прошедших с той апрельской ночи, ПЦР нашла применение во всех отраслях биологии: опубликовано более 1000 работ, в которых была использована эта реакция. Идея ее так проста, что, учитывая значение ПЦР для развития биологических исследований, многим теперь кажется невероятным, что никто не додумался до нее раньше, хотя уже 15 лет все необходимые для проведения этой реакции компоненты были доступны… "

   Изящество, простота исполнения, непревзойденные показатели чувствительности принесли новому методу небывалую популярность. За короткое время ПЦР - анализ с быстротой молнии распространился по всему миру, снискав всеобщее признание не только при решении научно-исследовательских задач, но и в сфере практического клинического использования. В настоящее время метод ПЦР автоматизирован, довольно прост в исполнении и доступен в любой молекулярно-биологической лаборатории. Для получения ответа на интересующий вопрос достаточно смешать в пробирке необходимые компоненты и выделенную ДНК, затем поместить пробирку в управляемый термостат (амплификатор) и потратить несколько часов на ожидание результата.

   В любом живом организме каждую секунду происходят естественные циклы по репликации ДНК. ПЦР имитирует в пробирке эту реакцию и позволяет обнаружить "иголку в стоге сена" - единственную специфическую молекулу ДНК среди миллионов других носителей генетической информации. Благодаря этому методу можно в течении нескольких часов выделить и размножить (амплифицировать) определенную последовательность ДНК в миллиарды раз. Таким образом, концентрация ДНК становится доступный для ее обнаружения.

   По данным известного журнала Lab.Medica International наиболее динамично на сегодняшний день развиваются пять основных направлений генодиагностики на основе ПЦР:

  • Диагностика инфекционных заболеваний
  • Диагностика онкологических заболеваний
  • Диагностика генетических заболеваний
  • Идентификация личности
  • Диагностика патогенов в пище

   Описывая возможности и преимущества ПЦР, хотелось бы подробно остановиться на аспектах практического применения данного метода при диагностике инфекционных заболеваний, как человека, так и животных.

    1.      Прямое определение наличия возбудителя.

   Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ выявляют белки-маркеры (антигены или антитела), что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Обнаружение специфического участка ДНК-возбудителя методом ПЦР указывает на присутствие самого возбудителя инфекции.

    2.      Высокая чувствительность.

   Метод ПЦР позволяет выявить даже единичные клетки бактерий или вирусов и обнаруживает наличие возбудителя даже в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

    3.      Высокая специфичность.

   ПЦР - диагностикумы, в отличие от иммунологических тест-систем позволяют избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами (антителами), тем самым, обеспечивая абсолютную специфичность. Это обусловлено тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК, который отсутствует у других видов бактерий или вирусов.

    4.      Универсальность процедуры выявления различных возбудителей.

   Определение ДНК возбудителя проводится непосредственно в клиническом материале. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот - "кирпичиков" из которых состоит ДНК позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать из одной пробы  самых разных возбудителей. В качестве исследуемого материала, могут использоваться любые биосубстраты: кровь, слюна, моча, кал, соскобы эпителия, мокрота, биопсийный материал, корма, смывы с объектов внешней среды (вода, почва) и т.д.

    5.      Возможность диагностики не только острых, но и хронических инфекций.

   Наиболее эффективен метод ПЦР при диагностике трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов (например - вирус гепатита С, микобактерия туберкулеза, вирус лейкоза КРС). Применение ПЦР анализа также весьма оправдано при диагностике возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов (микоплазмы, хламидии, многие вирусы).

    6.      Высокая скорость получения результата анализа.

   Для проведения ПЦР - диагностики не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что обычно занимает большое количество времени. Унифицированный подход к обработке биоматериала, проведения реакции амплификации и детекции продуктов реакции позволяет провести полный анализ в течение одного рабочего дня.

   В заключение, следует отметить что несмотря на значительное преимущество метода ПЦР перед обычными методами диагностики, никакой, даже самый совершенный анализ никогда не заменит клинического мышления. Данная технология служит лишь мощным вспомогательным инструментом, который дается врачу для понимания сути процессов, происходящих в организме при столкновении с патогенным вирусом или бактерией. Умение правильно интерпретировать полученные результаты ПЦР - исследований служит непременным условием успешной и своевременной диагностики.

 

ПЦР

 

ПЦР - полимеразная цепная реакция. МЦ «Наследственность» предлагает диагностику вялотекущих, хронических и острых инфекций методом полимеразной цепной реакции. Для правильного и своевременного лечения заболеваний, вызываемых различными инфекционными агентами, необходимо установление точного диагноза. Для решения этой проблемы в последние годы применяются современные методы молекулярной биологии. В настоящее время метод ПЦР широко используется в практической медицине.

 

В основе метода лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК, который является маркерным для данного вида вируса или бактерии.

 

Достоинства  метода полимеразной цепной реакции (ПЦР):

 

  • ПЦР играет ведущую  роль  в диагностике хронических инфекционных состояний, обусловленных персистенцией бактерий или вирусов.
  • ПЦР - незаменимый метод диагностики при идентификации практически всех внутриклеточных и мембранных паразитов, таких как вирусы, риккетсии, хламидии, микоплазмы.
  • ПЦР - обладает высокой специфичностью - до 98-100%.
  • ПЦР - высоко чувствительный метод и позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. Чувствительность ПЦР - анализа составляет 10 - 1000 клеток в пробе.
  • ПЦР отличает универсальность процедуры выявления различных возбудителей. Можно диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы. Выявление ДНК инфекционного агента можно проводить в любом клиническом материале (кровь, сыворотка, моча, мазки, соскобы эпителия, лаважные массы, мокрота, слюна, слизь, желудочный сок, биопсийный материал, смывы и др.).
  • Еще одним из преимуществ данного метода является высокая скорость получения результата анализа, так как для проведения ПЦР - анализа не требуется выделение, и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4- 4,5 часа.

 

Диагностика методом ПЦР наиболее актуальна при многих  заболеваниях.

Актуальность ранней диагностики туберкулеза определяется тем, что заключительный диагноз заболевания ставиться только после выделения чистой культуры микобактерий туберкулеза, что занимает 3-4 недели. Доказано, что ПЦР - диагностика позволяет идентифицировать возбудителей у 91 % больных, тогда как микроскопия совместно с бактериологическими методами способны подтвердить клинический диагноз только у 40% больных.

 

Актуальны диагностические возможности ПЦР применительно к персистирующим формам микробов, например, при хламидиозе, бессимптомное носительство Chlamydia trachomatis встречается очень часто. В настоящее время ПЦР начинает занимать лидирующее место в диагностике хламидиоза. Преимущество ПЦР - анализа перед культуральным методом обнаружения хламидий («золотым стандартом») состоит в следующем:

  • Более высокая частота обнаружения микроба, превышающая  культуральный метод  на 6-7%. Эти различия объясняются возможной гибелью микроба  при хранении и транспортировке, тогда как ПЦР способна обнаруживать и  нежизнеспособные формы микроорганизма.
  • Время, необходимое, для  обнаружения микроба культуральным методом, составляет около 4 суток, тогда как использование ПЦР позволяет обнаружить микроб через 4 - 5 часов.
  • Использование технологи ПЦР позволяет проводить определение хламидий в образцах, взятых неинвазивным путем, например, в моче, соскобе с задней стенки глотки, слезе и мазке с конъюнктивы.

   

Наиболее явные преимущества метода  ПЦР  обнаружены при диагностике вирусного гепатита С. Особая диагностическая ценность ПЦР для обнаружения HCV состоит в следующем:

 

  • Отсутствие способа культивирования вируса гепатита С;
  • Не существует наборов для антигенной диагностики;
  • Реакция образования антител на гепатита С настолько замедлена, что диагноз во время острой фазы инфекции, как правило, невозможен. Около 20% хронически инфицированных имеют низкие титры антител и около 10% являются серонигативными.

У больных РНК вирусного гепатита С обнаруживают в плазме крови уже в течение  первой недели после предположительного заражения.  Это позволяет диагностировать острый гепатит С задолго до сероконверсии.

Метод ПЦР при инфицировании вирусами  гепатита позволяет судить о наличии возбудителя в сыворотке и клетках крови, в тканях печени, а также в иных органах и тканях. По мнению д.м.н. Крель П.Е.(ведущий научный сотрудник академической группы академика РАМН В.В. Серова) наиболее достоверную информацию о репликации вирусов гепатита дает ПЦР, кроме того, ПЦР помогает сделать выбор между глюкокортикоидами и противовирусной терапии. В процессе лечения, особенно больных ХГС, активность аминотрансфераз мало информативна  для суждения об эффективности терапии. ПЦР указывает на необходимость изменения дозы, схемы лечения, замены одного препарата другим, использования комбинации средств. Только отрицательный результат ДНК вирусного гепатита В и РНК вирусного гепатита С может быть сигналом к прекращению терапии, поскольку нормализация активности аминотрансфераз опережает исчезновение из сыворотки крови ДНК и РНК вирусов гепатита. Кроме того единственным ориентиром при лечении больных с постоянно нормальной активностью аминотрансфераз служит обнаружение методом ПЦР ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С. ПЦР позволяет провести генотипирование вирусного гепатита С, дать количественную оценку виремии (вирусная нагрузка – определяется методом ПЦР в режиме «реального времени»). Течение, исходы и результаты лечения интерфероном вирусного гепатита С зависят от генотипа вируса. Обладающие высокой репликативной способностью генотипы 1в и 4а являются наиболее опасными, и развитие цирроза печени происходит существенно чаще.

 

В последние десятилетия доказана этиологическая роль  Helicobacter pylori  в развитии язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, а также хронических гастродуоденитов. В семьях, где один или оба родителя страдают геликобактерной инфекцией, в 80 - 100% к семилетнему возрасту дети также инфицируются патогенным штаммом H. рylori. Методика ПЦР позволяет

обнаружить этот микроб не только в слизи и биоптате слизистой оболочки желудка, но и неинвазивным методом - из соскоба мягкого зубного налета, взятого из десневого кармана, который является одним из «резервуаров хранения» бактерии. ( В.Т.Ивашкин, Ф. Мегро, Т.Л. Лапина, город Москва).

 

Актуальна в педиатрии в настоящее время проблема респираторного хламидиоза определяемого в группе часто болеющих детей. Внутриутробные инфекции  занимают от 10-61% в структуре младенческой смертности и относятся к группе заболеваний, диагностика которых связана с определенными трудностями. В связи с этим до настоящего времени отсутствуют четкие данные о частоте внутриутробных инфекций. Отсутствие специфических клинических проявлений, возможность появления вирусно-вирусных, вирусно-бактериальных и вирусно-бактериально-грибковых ассоциаций делают проблему точной верификации возбудителя и определения адекватных подходов к лечению полиэтиологичной перинатальной инфекции особенно актуальной.

В настоящее время признана роль Chlamydia trachomatis в развитии неонатальной пневмонии. Инфекция, вызванная C. trachomatis, сопровождается развитием затяжной пневмонии с выраженной дыхательной недостаточностью (до III ст.), нарушениями гемоликвородинамики, желтушным окрашиванием кожных покровов. В случаях проведения ИВЛ для ПЦР -диагностики могут использоваться трахеобронхиальные аспираты.

Диагноз хламидийной инфекции не всегда устанавливается своевременно, что приводит к неадекватной терапии и формированию персистирующей или латентной инфекции, способствующей развитию вторичного иммунодифицита и аутоиммунных  заболеваний.

Диагностика микоплазм с использованием ПЦР  позволяет установить этиологическое и патогенетическое   значение микоплазм в патологии неонатального периода. Инфекция, вызываемая Ureaplasma urealyticum, играет важную роль в развитии ранней  бронхолегочной дисплазии  у недоношенных детей и других хронических заболеваний легких, даже после лечения сурфактантом.

Предупреждение серьезных последствий у новорожденных детей зависит от ранней диагностики ВУИ и своевременного лечения.

Все выше изложенное позволяет считать метод ПЦР иногда незаменимым, хотя и не единственным для диагностики вялотекущих и трудно выявляемых инфекций. 

 

    Технология ПЦР.

 

Исследуемые образцы, доставляются в ПЦР лабораторию.

В процессе работы проходят 3 этапа.

 

1.Выделение. Т.к. ДНК содержится не в чистом виде, процесс необходим, чтобы очистить ДНК от различных примесей белки, кровь, слизь и т.д.

В процессе выделения получают очищенную ДНК в растворе (элюенте).

Для этого доставленную пробу лизируют,   то есть «сажают» на сорбент ингибирующие (тормозящие реакцию) агенты (белки, соли) и клетки, и затем отмывают спиртосодержащими растворами. Полученный осадок сорбента элюируют (растворяют), очищенная ДНК переходит в раствор.

 

2.Амплификация- процесс размножения (увеличения копий) генов.

Для этого создают определенные условия:

А. Нужную ионную силу

Б. Подходящие для конкретной инфекции (возбудителя) праймеры.

Праймеры – это фрагменты ДНК, ограничивающие выбранный ген с 2-х сторон

В. Смесь нуклеотидов, участвующих в строительстве ДНК

Г. Фрагмент полимеразу (строитель ДНК).

Затем задают определенный температурный режим, при котором будет синтезироваться только конкретная инфекция (возбудитель) с помощью прибора «ТЕРМОЦИКЛЕРА»

 

Процесс амплификации происходит так:

 

1. Денатурация или расплетение ДНК

при температуре 950С –2-нитчатая ДНК расплетается  до однонитчатой.

2. Присоединение (отжиг) праймеров

При температуре 62-650С к однонитчатой ДНК присоединяются праймеры (с 2- х концов выбранного гена инфекции (возбудителя) и полимеразы.

3. Синтез фрагмента или комплекс достраивания цепей ДНК

При температуре 720С идет собственно достройка ДНК до 2- нитчатой с помощью нуклеотидов, находящихся в растворе.

 Этот процесс достроения повторяется 40-45 раз.

Обязательно ставят контроли положительный данный производителем, т.е там находится заведомо положительна проба и отрицательный вода. Это для того чтобы  посмотреть чисто ли прошла реакция на занесли ли мы грязь при постановке.

В итоге образуется очень много копий ДНК выбранного гена.

 

3. Электрофорез  в агорозном геле позволяет обнаружить инфекцию.

Варят гель, затем его заливают в планшет с лунками в лунки капаются пробы и обязательно контроли.

Затем подключают ток. Под действием силы тока молекулярные  фрагменты движутся со скоростью обусловленной их молекулярной массой.

Зная вес амплифицированного гена мы можем идентифицировать каждую инфекцию.

 

Результаты электрофореза фотографируются и слайды просматривают на ПК.

 

 

 

Результаты анализов он-лайн
Created by GraphitPowered by TreeGraph